Удачей для Флеминга можно назвать еще один факт. В те дни в Лондоне стояла небывалая жара — температура в лаборатории поднялась настолько, что практически сравнялась с температурой в инкубаторе. Но именно в тот день, когда он открыл свою чашку Петри и допустил попадание в нее частиц плесени, жара спала. В лаборатории стало прохладнее, и температура осталась достаточно низкой, чтобы во время отпуска Флеминга споры спокойно разрослись.

Будучи по-настоящему внимательным исследователем, Флеминг не стал выбрасывать культуру стафилококков, загрязненную плесенью. Увидев, что желто-зеленое разрастание плесени Penicillium окружено широкой полосой, совершенно свободной от стафилококков, тогда как остальная поверхность агар-агара кишела этими бактериями, он сразу же понял, что стоит на пороге открытия. И, несмотря на свою занятость другими исследованиями и выгодной частной практикой по введению сальварсана в вены богатых лондонских сифилитиков, он решил разобраться в странной ситуации, с которой столкнулся, вернувшись в лабораторию из отпуска.

Задумав новое исследование плесени и ее странной способности останавливать рост стафилококков, Флеминг прежде всего решил проверить, может ли эта плесень тормозить рост и каких-то других бактерий. Для этого ему пришлось разработать подходящую методику. Вскоре он обнаружил, что питательная среда, на поверхности которой плавала растущая плесень, содержала субстанцию, обладающую антибактериальными свойствами. Флеминг назвал эту до сих пор неизвестную субстанцию пенициллин. Далее, он увидел, что эта субстанция, каким бы ни было ее происхождение, растворима и без труда проходит через бактериальный фильтр. Кроме того, он отметил, что пенициллин скапливается в питательной среде, на поверхности которой разрастается плесень, постепенно достигая максимальной концентрации примерно через восемь дней после начала роста плесени.

Метод проверки, придуманный Флемингом, отличался простотой и изобретательностью. Он разделил поверхность агар-агара в чашке Петри на две части, оставив между половинками узкий канал. В этот канал он поместил несколько капель питательной среды со зрелой плесенью, содержащей пенициллин. После этого он наносил мазки культур различных видов бактерий так, чтобы они проходили через канал и далее по поверхности агар-агара. Каждый мазок бактериальной культуры начинался от канала и шел к краю чашки с питательной средой. Флеминг исходил из того, что, поскольку пенициллин в культуре, которую он поместил в канал, будет так или иначе распространяться по агар-агару от этого канала к периферии, виды бактерий, чувствительные к пенициллину, не смогут размножаться рядом с каналом.

С помощью этого метода Флеминг установил, что возле канала, содержавшего пенициллин, не росло большинство видов стафилококков, пневмококков, стрептококков, гонококков и менингококков, вызывающих смертельные инфекционные заболевания. Однако, будучи весьма эффективным по отношению к этим видам бактерий, пенициллин не оказывал практически никакого действия на другие бактерии, в частности на бациллы, вызывающие туберкулез, гриппозные заболевания и тифозную лихорадку.

Странно, что Флеминг, считавшийся в Англии ведущим специалистом по лечению сифилиса, не попытался проверить влияние пенициллина на рост спирохеты, возбудителя этой страшной болезни. Решись он на такой эксперимент, и тут бы получил блестящие результаты. Сегодня мы знаем, что с помощью пенициллина или его производных вылечить сифилис можно за несколько недель, а сальварсан, считавшийся тогда лучшим средством против сифилиса, требовал еженедельных внутривенных вливаний в течение полутора лет!

Флеминг изучал другие виды Penicillium, чтобы определить, обладают ли какие-то из них аналогичными антибактериальными свойствами, однако эффективным оказался один-единственный вид плесени, споры которого случайно попали в открытую им чашку Петри в тот судьбоносный сентябрьский день 1928 года. Флеминг ввел фильтрат питательной среды, содержащей Penicillium, кролику и мыши, и увидел, что это не повлекло за собой никаких нежелательных последствий.