В Милане Леонардо начал делать записи; около 1490 года он сосредоточил внимание на двух дисциплинах: архитектуре и анатомии. Он сделал наброски нескольких вариантов проекта центрального купольного храма. Леонардо нарисовал план и перспективные виды всего сооружения. Примерно в это же время он добыл череп и сделал поперечное сечение, впервые открыв пазухи черепа. Заметки вокруг рисунков свидетельствуют о том, что его в первую очередь интересовала природа и строение мозга. Безусловно, эти рисунки предназначались для чисто исследовательских целей, однако они поражают своей красотой и сходством с набросками архитектурных проектов в том, что и на тех, и на других изображены перегородки, разделяющие части внутреннего пространства. Живя в Милане, Леонардо постоянно работал над проектом огромного конного монумента Франческо Сфорца, отца Лодовико, который должен был быть отлит из 90 т бронзы и помещён на шестиметровый пьедестал. Однако случилось так, что предназначенная для памятника бронза была использована для отливки пушек, а его глиняная модель была уничтожена в 1499 году при вторжении французов.

Размышления Леонардо о пространстве, линейной перспективе и о способах выражении разнообразных эмоций в живописи вылились в создание фрески, написанной в экспериментальной технике на дальней торцовой стене трапезной монастыря Санта-Мария делле Грацие в Милане в 1495–1497 годах. При помощи иллюзорных средств Леонардо расширил реальное пространство зала в область живописного пространства, с высоким столом, за которым сидят Христос и апостолы. Он изобразил тот момент, когда Христос сказал: «Истинно говорю вам, что один из вас предаст меня». Здесь Христос — центр композиции. Все средства использованы для того, чтобы подвести взгляд к фигуре Христа: и основные цвета одежды (красный и синий), и изображение Спасителя таким образом, что его силуэт выделяется на фоне окна. Фигура Иуды (четвёртый справа от Христа) смещена со своего обычного места с внешней стороны стола, что ещё более усиливает драматизм происходящего. Двенадцать апостолов распределены на четыре группы по трое и изображены либо склонёнными к Христу, либо отпрянувшими от него.

Поскольку расположение тринадцати человек по одну сторону стола несколько неестественно, их прямое сопоставление поднимает эмоциональный накал, а уходящая вглубь перспектива (комната изображена в виде трапеции) создаёт эффект «выталкивания» фигур к зрителю. Возможно, черпая вдохновение у своего друга Луки Пачоли (ок. 1445–1517), для книги которого «О божественной пропорции» (1509) Леонардо сделал несколько иллюстраций, он выстроил композицию фрески по системе пропорций, аналогичной соотношениям музыкальных интервалов.

Деятельность Леонардо в первое десятилетие XVI века была столь же разнообразна, как и в другие периоды его жизни. Несмотря на увлечение математикой, он продолжал заниматься живописью. В это время было создано полотно «Мадонна с Младенцем и святой Анной», и около 1504 года Леонардо начал работу над своей знаменитой картиной «Мона Лиза», портретом жены флорентийского купца. Этот портрет (он находится в Лувре) является дальнейшей разработкой типа, появившегося у Леонардо ранее: модель изображена по пояс, в лёгком повороте, лицо обращено к зрителю, сложенные руки ограничивают композицию снизу. Одухотворённые руки Моны Лизы так же прекрасны, как лёгкая улыбка на её лице и первобытный скалистый пейзаж в туманной дали.

Джоконда известна как образ загадочной, даже роковой женщины, однако эта интерпретация принадлежит XIX веку. Более вероятно, что для Леонардо эта картина была наиболее сложным и удачным упражнением в использовании сфумато, а фон картины — результат его исследований в области геологии. Вне зависимости от того, был ли сюжет светским или религиозным, пейзаж, обнажающий «кости земли», постоянно встречается в творчестве Леонардо.