В 1564 году вторую, и более подготовленную, попытку предприняли 300 колонистов, которые отплыли в Америку под началом одного из лейтенантов Рибо. На этот раз колонисты высадились у реки Сент-Джон на севере Флориды. В нескольких милях выше по течению реки они основали поселение, которое назвали фортом Каролина, снова в честь короля. Конечно, они находились на территории испанцев, но в то время Испания еще не основала настоящих поселений на полуострове, и колонисты чувствовали себя в безопасности. В 1565 году сам Рибо приплыл с новыми колонистами, и положение гугенотов выглядело обнадеживающим.

Испанцы, однако, пришли в ярость. Для Испании было плохо уже то, что это французы, так как Испания в то время вела затяжную войну с Францией, но французские протестанты были еще хуже. Испания была самой фанатичной католической страной в Европе, и они не могли потерпеть поселений протестантов на территории, которую считали своей.

Король Испании Карл I отрекся от престола в 1556 году, и теперь правил его сын, Филипп И. Филипп считал себя главой сил католицизма в Европе, и он начал действовать. Он назначил Педро Менендеса де Авилу губернатором Флориды и дал ему особые инструкции уничтожить колонию гугенотов.

Менендес отплыл во Флориду и в конце августа 1656 года основал Сент-Августин, поселение на берегу примерно в пятидесяти километрах к югу от колонии гугенотов. С тех пор на этом месте живут люди, так что это первый город, основанный европейцами на территории континентальных Соединенных Штатов. (Сан-Хуан в Пуэрто-Рико, над которым развевается американский флаг, старше, так как он был основан в 1510 году.)

Менендес повел свои корабли на север против гугенотов. Сделав вид, что хочет напасть с моря, чтобы удержать корабли Рибо в море, Менендес послал отряд людей на сушу, в селение гугенотов. Испанцы захватили его, а потом убили всех французов, каких сумели найти, объявив, что поступили так не с французами, а с протестантами. Позже корабли Рибо потрепал шторм, а сам Рибо был захвачен испанцами и убит.

Так закончились попытки гугенотов основать колонию в Соединенных Штатах; первое испытание Америки в качестве религиозного убежища закончилось провалом. Оно лишь подтолкнуло Испанию к тому, чтобы утвердиться во Флориде и укрепить свое положение на этом континенте.

Однако Испания потянулась слишком далеко. Она посылала своих людей и свои корабли через мировые океаны в дальние уголки империи, в которую входили не только американские континенты, но и различные регионы Европы и Дальнего Востока. Она продолжала вести непрерывные войны повсюду, стараясь уничтожить протестантизм, а это вело ее к банкротству.

Конечно, богатство в виде золота и серебра попадало в Испанию из шахт в Америке, но это не принесло ей большой пользы. Наводнившие Европу металлы просто взвинтили цены, и испанский король Филипп II обнаружил, что чем больше у него золота, тем больше золота приходится платить за все.

Более того, Испания не развивала сельское хозяйство и промышленность теми темпами, какими это делали другие страны Европы. В результате золото из Америки приходилось менять на товары, которые другие страны поставляли в Испанию; страны, где были развиты транспортные перевозки и промышленность, богатели.

Среди тех стран, которые все больше процветали в XVI веке, была Англия. Около 1530 года король Англии Генрих VIII порвал с Римом и при нем, как и при его сыне Эдуарде VI, который сменил его в 1547 году, Англия стала официально протестантской страной.

Эдуард VI умер в 1553 году, и на трон взошла его сводная сестра-католичка Мария I. Она вышла замуж за Филиппа II, и какое-то время казалось, что Англия снова станет католической. В 1558 году, однако, Мария умерла бездетной; трон перешел к протестантке Елизавете I. Англия навсегда осталась протестантской.

Во время долгого правления Елизаветы нарастала враждебность к Испании, так как Филипп II стремился во что бы то ни стало избавиться от Елизаветы и посадить на трон ее двоюродную сестру (Марию Стюарт).