В конце сентября 1937 года Софья Ивановна уехала в Сухуми на лечение. В письмах к ней Антонов-Овсеенко иногда касался своих служебных дел. В одном из них явственно звучали тревожные нотки. 1 октября 1937 года (за день до ареста) он писал: «…Чувствую напряженность борьбы».

В. А. Антонов-Овсеенко был арестован в ночь с 11 на 12 октября 1937 года. Ордер на арест был подписан заместителем наркома внутренних дел Фриновским. Сразу же были произведены обыски в его квартире, в служебном кабинете и на даче в поселке Николина Гора. Владимир Александрович был доставлен во внутреннюю тюрьму НКВД, а уже 13 октября 1937 года направлен в Лефортовскую, где он находился до 17 ноября. Затем он попал в Бутырскую тюрьму, где содержался до 8 февраля 1938 года, а затем вновь возвращен в Лефортовскую.

В Лефортовской тюрьме Владимир Александрович вызывался на допросы не менее 15 раз, причем 7 раз его допрашивали по ночам. Трижды (14, 15 и 17 октября) он вызывался на допросы по два раза. Наиболее продолжительным по времени был первый ночной допрос 13 октября (7 часов). Допрашивали в основном работники госбезопасности Ильицкий и Шнейдерман. Первые двое суток он категорически отвергал все возводимые на него обвинения, говорил, что ни в чем не виноват, что допущена ошибка и требовал от следователя предоставить ему «уличающие материалы». Затем появилось его короткое «признательное» письмо на имя Ежова. В нем Антонов-Овсеенко писал: «Контрреволюционный троцкизм должен быть разоблачен и уничтожен до конца. И я, оруженосец Троцкого, раскаиваясь во всем совершенном против партии и Советской власти, готов дать чистосердечные признания. Надо прямо сказать, что обвинения меня врагом народа правильно. Я на деле не порвал с контрреволюционным троцкизмом… Эта контрреволюционная организация ставила себе целью противодействие социалистическому строительству, содействие реставрации капитализма, что ее смыкало по существу с фашизмом… Я готов дать развернутые показания следствию о своей антисоветской, контрреволюционной работе, которую осуществлял и в 1937 году».

Можно с уверенностью предположить, что после вырванного у В. А. Антонова-Овсеенко признания, он вновь отказался от своих показаний и стал все отрицать. Лишь этим можно объяснить тот факт, что, несмотря на неоднократные вызовы к следователю, протоколы допросов не составлялись. В них просто нечего было писать. Потом следователи все-таки «вернули» его к признательным показаниям, но только до суда.

Обвинительное заключение по делу В. А. Антонова-Овсеенко было составлено работником госбезопасности Ильицким и утверждено 5 февраля 1938 года заместителем Прокурора СССР Рогинским. Он обвинялся в том, что еще в 1923 году, работая начальником ПУРа, совместно с Л. Д. Троцким разрабатывал план вооруженного выступления против Советской власти, а затем, занимая должность полпреда в Чехословакии, Литве и Польше, вел «троцкистскую деятельность в пользу польской и германской военных разведок». Не забыт был и испанский период службы. В обвинительном заключении указывалось, что Антонов-Овсеенко вошел в организационную связь с германским генеральным консулом и фактически руководил троцкистской организацией в Барселоне в «борьбе против Испанской республики».

Ордер на арест жены В. А. Антонова-Овсеенко Софьи Ивановны был выдан 12 октября 1937 года. На следующий день в Абхазию, где она тогда отдыхала, полетела шифрованная телеграмма, а 14 октября ее уже арестовали в Сухуми, в доме отдыха Синоп, и этапировали в Москву.