Прежде чем приступить к росписи, Рафаэль сделал более пятидесяти рисунков, а для всего цикла более трёхсот. Первые рисунки касались фрески, названной «Диспут» (в нашей литературе часто называемой по непонятной причине на итальянский манер «Диспута»), которой была отведена главная смысловая нагрузка. Об этой фреске, как ни об одном другом творении Рафаэля, имеется богатейшая литература, поскольку в ней отражено всё своеобразие философской мысли итальянского Возрождения.

Общепризнано, что цикл начинается с фрески «Диспут», на которой пространство ограничено мощным декоративным полукружием и дугой, отделяющей мир горний от мира земного. Само это пространство раскрывается перед зрителем уходящей от него далеко вглубь перспективой, а сравнительно небольшая станца в виде вытянутого прямоугольника расширяется, и всё внимание зрителя сосредоточивается на алтаре с дарохранительницей как духовном центре события и в то же время являющемся точкой схода всех параллельных линий.

Начатая в конце 1508 года работа над всем живописным циклом Станцы делла Сеньятура была полностью завершена к 1511 году, о чём имеется пометка под фреской «Парнас». Её свод расписан сценами, являющимися своеобразным эпиграфом к каждой из них. Так, над фреской «Диспут» помещена люнета с аллегорией Теология в виде женской фигуры с белым покрывалом и зелёным плащом поверх красной туники (цвета теологических добродетелей), а два путти держат таблички с надписью на латыни Divinarum rerum notitia из почитаемого гуманистами Кодекса Юстиниана, что означает «Знание божественных вещей».

Композиция «Диспута» напоминает огромную апсиду раннехристианского храма с широкими мраморными ступенями, ведущими к алтарю, на котором установлена дарохранительница с облаткой, называемой просвирой или ostia по-итальянски, как неотъемлемая часть евхаристии. Стоит заметить, что в первоначальных рисунках Рафаэля алтарь как таковой отсутствовал, из чего можно заключить, что на художника, далёкого от теологических тонкостей и думающего только о выигрышном композиционном решении сюжета на огромном пространстве стены, было оказано немалое давление, о чём он сам говорил в упомянутом выше письме болонскому другу.

Главными контрастными тонами являются синий и жёлтый, интенсивные в земной половине и более лёгкие и размытые в небесной. Фреска носит сугубо программный характер, что отражено на четырёх табличках в руках резвых путти, устремляющихся к миру земному вместе с голубем, олицетворяющим Святой Дух Троицы, пребывающей в заоблачных высях.

Если сложить вместе разрозненные таблички, то текст читается так: «Jurisprudentia est divinarum atque humanarum rerum notitia, justi atque injusti scientsia», то есть «Юриспруденция есть знание божественных и человеческих вещей, наука о справедливом и несправедливом».

Работа над «Диспутом» изрядно утомила Рафаэля. Под постоянным контролем приставленных советников ему приходилось строго соблюдать церковную иерархию, рассаживая по обе стороны от Святой Троицы апостолов, пророков и святых мучеников. Первым сидит Пётр, изображённый в профиль. Здесь же Иоанн Богослов, погружённый в чтение Евангелия и не слышащий, что ему говорит царь Давид. Мученик Стефан указывает, по-видимому, пророку Иеремии на происходящее на земле. По другую сторону от Святой Троицы едва различимый Георгий-воин и дьякон Лаврентий с пальмовой ветвью мученика, увлечённо наблюдающий за полётом ангелов. Рядом пророк Моисей со скрижалями и задумавшийся апостол Иаков с книгой на коленях. Пророк Авраам, повернувшись, смотрит на апостола Павла, замыкающего ряд и изображённого в профиль.