Не в характере Караваджо было особо горевать, и он приказал себе не думать больше о вероломной подружке. Это давалось ему с трудом, ревность разъедала душу, но дел было по горло. Уже дважды напоминал о контракте адвокат Керубини, поскольку отделочные работы в Санта-Мария делла Скала на Трастевере были давно завершены. В итоге художник приступил к написанию одной из лучших своих монументальных работ «Успение Богоматери» (369x245). Чтобы установить сколоченный плотниками с улицы Маргутта громоздкий подрамник с натянутым на него загрунтованным холстом, пришлось дополнительно расширить отверстие в потолке без ведома хозяйки дома. Хотя по высоте будущая картина позволяла отобразить также сцену Вознесения, как того хотел заказчик, художник ограничился показом трагического Успения, а остальное зритель в состоянии домыслить сам, что вполне позволяет плоскость картины вертикального формата. Он помнил о своём ошеломляющем впечатлении от «Ассунты» Тициана и поэтому не осмелился затронуть тему Вознесения, посчитав, видимо, что не был к ней ещё готов, а состязаться с великим мастером, как безуспешно пытался тщеславный Чезари, ему не хотелось.

Поскольку работа писалась для церкви в Трастевере, районе, населённом в основном беднотой, художник старался передать царившую там атмосферу. На картине убогое и мрачное помещение с непомерно высоким кессонным потолком. Только что поднят с помощью висящего шнура тяжёлый балдахин кровавого цвета и за ним открылась сцена, преисполненная подлинно трагедийного звучания. Всё внимание автора сосредоточено на раскрытии типических характеров простых людей, которых сплотило постигшее их великое горе. В центре бездыханное тело Девы Марии, написанной автором по памяти, так как Лену ему не удалось отыскать. Рядом тесно стоящие апостолы. Двое из них не в силах сдержать рыдания прикрывают руками лица. У изголовья стоит, подперев рукой опущенную голову, Иоанн, перешедший из «Положения во гроб». Особо выделяются мощные фигуры Петра и Павла; один из них поднял руку, как бы призывая остальных к молчанию в надежде, что Мария вот-вот очнётся ото сна. Среди умолкших и стоящих в оцепенении молодых и пожилых учеников Христа художник, вероятно, изобразил заказчика Керубини, перед которым чувствовал вину за проволочку — на голове у него широкополая крестьянская шляпа.

На переднем плане у самого края полотна — согбенная фигура плачущей Марии Магдалины, сидящей на низком стульчике. Она также написана не с натуры, но у неё те же заплетённые косички, как у Лены на предыдущей картине. Несмотря на горе, обрушившееся на людей, картина в отличие от «Положения во гроб» лишена патетики, резких движений и внешних эффектов. Живопись стала намного мягче, ей присуща сдержанная серовато-коричневая тональность с преобладанием красных тонов. Прозрачнее выглядят даже тени, появилась едва ощутимая в глубине воздушная среда. Луч света слева скользит по диагонали вдоль мрачной стены, а затем по головам, лицам, рукам, одежде и замирает на усопшей Марии, лежащей на коротком ложе. Приподнятый край хитона обнажил её голые ноги выше щиколоток, которые свешиваются, не уместившись на смертном одре. Руки по обычаю не скрещены, а лежат свободно — одна прижата к груди, другая откинута в сторону, словно указывая на плачущую рядом Магдалину. На прекрасном молодом лице с высоким лбом веки сомкнуты, но рот приоткрыт, как это бывает у спящих. Над головой едва различимый нимб — единственная уступка условности. Красноватый хитон Марии перекликается с цветом нависшего сверху тяжёлого полога.