Молекула гемоглобина состоит примерно из шестисот аминокислот. Одна аминокислота в ней встречается около семидесяти пяти раз, другая — всего один раз, а остальные количественно представлены примерно равномерно. Поскольку они не расположены в повторяющемся порядке, проблема определения, где находится какая аминокислота, кажется неразрешимой. Число возможных комбинаций аминокислот в молекуле гемоглобина более чем 10⁶¹⁹, то есть единица с 619 нулями. Это порядочное количество. Как в нем разобраться?

Известно, что каждая молекула гемоглобина состоит из двух одинаковых частей, поэтому можно узнать расположение только трехсот аминокислот в половине молекулы, но и это тоже непросто. Молекулу необходимо расщепить на более мелкие части.

Вернон М. Ингрэм из Кембриджского университета сделал это, обработав молекулу гемоглобина пищеварительным ферментом — трипсином. Трипсин вызывает расщепление цепи аминокислот в тех местах, где расположены аминокислоты лизин и аргинин. В результате половина молекулы гемоглобина распадается на двадцать восемь фрагментов.

Эти фрагменты представляют собой короткие цепочки аминокислот, которые называют пептидами. Некоторые пептиды могут состоять всего из двух или трех аминокислот, другие — из дюжины или больше, в зависимости от расположения групп лизина и аргинина в исходной цепочке. Естественно, все двадцать восемь пептидов смешаны между собой, и их нужно разделить.

Для этого каплю смеси помещают на пористую бумагу (фильтровальную бумагу, которая первоначально использовалась в химических лабораториях для фильтрования — отделения твердых частиц от жидкости), которую затем смачивают нужным раствором. К ней прикрепляют два электрода и через бумагу пропускают электрический ток. Пептиды, подобно протеинам, устремляются к положительному или отрицательному электроду с разной скоростью, которая зависит от степени электрического заряда каждого пептида. Это и есть электрофорез на бумаге, о котором я уже упоминал.

В результате этого процесса пептиды делятся на несколько групп и распределяются в виде пятен по бумаге. Эти пятна нельзя рассмотреть невооруженным глазом, но их можно увидеть, если прибегнуть к некоторым манипуляциям. Бумагу можно обработать химическим составом, который вступит с пептидами в реакцию, в результате которой образуются окрашенные соединения. Или можно использовать ультрафиолетовые лучи, чтобы обычно невидимые вещества, поглотив их, проступили в виде темных пятен, стали черными или, наоборот, стали светиться. В каждом пятне локализовано несколько пептидов с одинаковыми электрическими свойствами, поэтому эти пептиды нужно разделять дальше. Это делается при помощи хроматографии, о которой стоит поговорить особо.

Хроматографию изобрел в 1906 году русский ботаник Михаил Цвет. Он хотел разделить различные пигменты из листьев растений. Эти пигменты были настолько схожи по химическому составу, что обычные методы разделения были не эффективны. Тогда Цвет использовал совершенно новый способ.

Он приготовил из смеси пигментов раствор и вылил его в колонку, наполненную измельченным известняком. Пигменты прикрепились к поверхности крошечных частиц в верхнем слое известняка, а жидкость, в которой они были растворены, прошла по колонке вниз и вышла из нее. Первоначально окрашенный раствор вышел бесцветным, а в верхней части колонки осталась цветная полоска пигмента.

Затем Цвет пропустил через колонку другую жидкость — петролейный эфир. Эфир медленно вымывал пигмент из известняка. Причем каждый пигмент вымывался с различной скоростью. Те, которые связывались с известняком слабо (или очень хорошо растворялись в петролейном эфире), вымывались довольно быстро; те, которые связывались более прочно (или плохо растворялись в эфире), вымывались медленнее.