В день венчания Ивана Грозного с Анастасией Романовной вспыхнувший на Арбате-Воздвиженке пожар дотла уничтожил и скромную обитель. Грозный распорядился перевести монахинь в Кремль, а в 1572 году отвел для монастыря место в Чертолье — там, где сейчас стоит нововозведенный храм Христа Спасителя. А в течение 1566–1593 годов на месте первоначального алексеевского земляного вала поднялись стены Белого города, западная часть которого была заселена опричниками. Опричнина определила значительную часть истории Арбата — от Кремля до нынешней Смоленской площади.

Возникновение опричнины истолковывалось (и продолжает истолковываться) по-разному. Одни историки усматривают в ней политический смысл — желание Ивана Грозного ослабить боярство, другие династический, поскольку право Ивана IV на престол могли оспаривать многие роды. Наиболее распространенной долгое время оставалась точка зрения С. М. Соловьева: «Опричнина была учреждена потому, что царь заподозрил вельмож в неприязни к себе и хотел иметь при себе людей вполне преданных ему. Напуганный отъездом Курбского и протестом, который тот подал от имени всех своих собратий, Иоанн заподозрил всех бояр своих и схватился за средство, которое освобождало его от них, освобождало от необходимости постоянного, ежедневного общения с ними».

3 декабря 1564 года Иван Грозный со своей второй женой царицей Марьей Темрюковной, «из черкасских девиц», царевичами, боярами, дворянами с семьями, вооруженной стражей, захватив всю казну и дворцовую святыню, выехал сначала в Коломенское, откуда тронулся в путь по различным монастырям. Путешествие закончилось в Александровой слободе (ныне — город Александров Владимирской области). Оттуда в Москву пришли две грамоты. Первая, адресованная митрополиту Афанасию, перечисляла вины боярства перед царем, начиная с раннего его детства, и заканчивалась заявлением, что царь оставляет свое государство и уезжает «поселиться, где Бог ему укажет». Вторая была обращена к москвичам, в отношении которых Иван Васильевич заявлял, что «гнева не имеет».

В возникшей сумятице и бояре, и простые москвичи одинаково просили царя вернуться с тем, что изменников он волен казнить как ему заблагорассудится. Это было условие, которого Иван и добивался. Когда в начале февраля 1565 года царь возвратился в Москву, он еще раз подтвердил свои данные ему народом полномочия и принялся за реформы, перевернувшие и всю страну, и тем более Москву. Из государства и города Грозный выделяет себе часть, которую называет опричниной. В опричнину была отделена часть бояр, дворян, служилых и приказных людей. Весь царский «обиход» стал особым: последовало назначение нового штата, во дворцах Сытном, Хлебенном и Кормовом — особый штат ключников, поваров, псарей, набраны особые отряды стрельцов. На содержание опричнины назначены двадцать городов с соответствующими волостями. В самой Москве в опричнину ушли улица Чертольская (ныне Пречистенка), Арбат, Сивцев Вражек, часть Большой Никитской и некоторые другие. Прежние жители были переселены на другие улицы.

В опричнину было набрано около тысячи князей, дворян и детей боярских. Рекруты должны были отличаться удалью. Им ставилось условием отречься от семьи, отца-матери, служить только и исключительно государю. Внешним их отличием служили прикрепленные к седлам собачьи головы и метлы как символ того, что они грызут и выметают всех изменников царю.

При этом все остальное государство и часть Москвы составляли «земщину» и подчинялись Боярской думе во главе с князем Иваном Дмитриевичем Вельским и князем Иваном Федоровичем Милославским. За свою былую поездку в Александрову слободу царь взыскал с Земщины неслыханную сумму в сто тысяч рублей.

Александровская слобода стала второй столицей Московского государства. Грозный вскоре переехал туда со своими опричниками.