Иосиф Волоцкий (к миру Иван Санин) был пострижен в монахи преподобным Пафнутием Боровским. Он стал его преемником по игуменству и попытался ввести в Пафнутиевом монастыре общежительный устав, но встретил противодействие братии. Тогда он ушел странствовать по монастырям вместе со старцем Герасимом, а в 1479 году вернулся в родные волоколамские пределы, испросил и получил согласие волоколамского князя Бориса Владимировича устроить мужской монастырь, в который сразу стали стекаться пожертвования.

На месте, указанном свыше, Иосиф поставил крест и часовню с образом Богоматери Одигитрии, подаренным преподобным Пафнутием. Вскоре Иосиф и князь Борис заложили здесь деревянный Успенский храм (освящен 15 сентября 1479 года). В 1486 году в новом монастыре выстроили каменный собор, расписанный знаменитым Дионисием, а в 1490-м – каменную колокольню.

При жизни основателя в монастыре был особый строжайший устав. Уже в те времена монастырь был значительным центром древнерусской культуры. В Иосифовом монастыре иночествовали Гурий и Герман, будущие просветители Казани.

Иосиф Волоцкий участвовал в церковных соборах 1490, 1503, 1504 гг., осуждал ересь «жидовствующих», был главой партии «осифлян», отстаивавших в спорах с «нестяжателями» право монастырей владеть землями и богатствами на том основании, что они необходимы инокам, чтобы служить бедным.

Монастырь приобрел особую знаменитость в XVI веке. Сюда стали ездить на моление цари и простолюдины. Монастырь был местом заточения врагов государевых и еретиков.

В монастыре были заточены многие знаменитые в истории: инок Вассиан Косой (в миру князь Василий Иванович Патрикеев-Косой), Максим Грек, которые осудили великого князя за развод с женой, Соломонией Сабуровой и насильственное ее пострижение в монахини, а также царь Василий Иванович Шуйский.

Во время русско-польской войны в начале XVII века здесь содержались польские военнопленные, в годы Отечественной войны 1812 года – пленные французы.

При жизни основателя в монастыре был особый строжайший устав. Уже в те времена монастырь был значительным центром древнерусской культуры. В. О. Ключевский писал: «Ни один русский монастырь не обнаружил литературного возбуждения, равного тому, какое находим в обители Иосифа».

Уже при жизни Иосиф прославился многими чудесами. Например, когда сын князя Бориса Иоанн умер без покаяния, Иосиф своею молитвой оживил его, исповедал и причастил, чтобы тот отошел в мир иной, как подобает христианину. Наследник и сын Бориса, похороненного в монастыре, князь Федор, притеснял монастырь в течение 10 лет. Потеряв терпение, Иосиф Волоцкий, нарушая феодальный суверенитет, «передался под руку» великого князя московского Иоанна Васильевича. Федор пожаловался новгородскому архиепископу Серапиону, в чьей юрисдикции находился Иосифов монастырь, и тот отлучил преподобного от церкви. Но московский митрополит Симон разрешил Иосифа от неправедного отлучения. Преподобный, которого в последние годы на руках носили в церковь, умер в 1515 году. В 1591-м его причислили к лику святых.

В XVI столетии в Иосифов монастырь часто приезжал Иван Грозный, делал сюда крупные вклады. Обитель была одной из богатейших на Руси. Все богатства она утратила в 1764 году при секуляризации.

Служила обитель и боевой крепостью. Первые каменные стены появились здесь еще в 1543–1566 годах. В Смутное время монастырь осаждали поляки, его захватил на время сподвижник Лжедмитрия II князь Рожинский, но был разбит отрядом воеводы Валуева. В память об этом событии в монастыре остались старинные пушки, из которых в XIX столетии стреляли во время водоосвящения.

Архитектурный ансамбль обители, напоминавший исследователям сказочный град Китеж на берегу озера, был завершен в XVII веке строительством большого собора и изумительной колокольни-«свечи».

С 1777 года по 1823 в монастыре существовала школа для детей священников.